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制药应用 | 数字PCR检测生物药酵母细胞残留DNA

发布日期(qi):2021-08-13

酵母细(xi)(xi)胞(bao)特别是毕赤酵母,是目(mu)前生产(chan)蛋白质类药(yao)(yao)物的(de)(de)常用宿(su)主细(xi)(xi)胞(bao)。宿(su)主细(xi)(xi)胞(bao)残留(liu)的(de)(de)DNA是生产(chan)工艺(yi)过程中的(de)(de)杂质,须对(dui)(dui)药(yao)(yao)物纯(chun)化工艺(yi)后的(de)(de)残留(liu)DNA进行(xing)监测(ce)和(he)去(qu)除,以确保药(yao)(yao)物的(de)(de)纯(chun)度和(he)安全(quan)性。目(mu)前,基(ji)于荧(ying)光定(ding)量(liang)(liang)(liang)PCR(qPCR)的(de)(de)方(fang)法被(bei)广泛应用于宿(su)主细(xi)(xi)胞(bao)残留(liu)DNA的(de)(de)定(ding)量(liang)(liang)(liang)检(jian)测(ce)。数字PCR(dPCR)技术在(zai)这(zhei)个(ge)领域的(de)(de)应用也在(zai)不(bu)断(duan)发展,它比qPCR具有更高的(de)(de)灵(ling)敏度和(he)绝对(dui)(dui)定(ding)量(liang)(liang)(liang)能力。与qPCR相比,用dPCR方(fang)法可以从大(da)量(liang)(liang)(liang)药(yao)(yao)物中检(jian)测(ce)到含量(liang)(liang)(liang)更低的(de)(de)酵母细(xi)(xi)胞(bao)DNA残留(liu),显示了(le)更高的(de)(de)灵(ling)敏度,并且该方(fang)法拥(yong)有较(jiao)好的(de)(de)检(jian)测(ce)精密度和(he)准确度。

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研究背(bei)景

许多蛋白质类药物如胰岛素等是在酵母细胞中制备的,然而宿主细胞产生的DNA杂质对患者用药构成安全隐患,各国监管机构对蛋白质类药物中DNA杂质的限量要求及其严格。大多数生物类药物厂商将蛋白质药物中宿主细胞残留DNA的标准定在每毫克药物≤1.0 pg。因此,使用一种非常灵敏的DNA检测和定量方法十分重要。

方法与结果

将(jiang)Merck公(gong)司(si)生产的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白质类药(yao)物人重组(zu)IgG-Fc(RP-1)药(yao)物和Sigma公(gong)司(si)制(zhi)备(bei)的(de)(de)(de)(de)胰岛素(su)配(pei)置成50 mg/mL的(de)(de)(de)(de)溶(rong)液,这两种生物药(yao)的(de)(de)(de)(de)宿主细胞均是酵(jiao)(jiao)母(mu)细胞,毕赤(chi)酵(jiao)(jiao)母(mu)总DNA在缓冲液中配(pei)制(zhi)成31 μg/mL。直(zhi)接将(jiang)RP-1和胰岛素(su)加入到(dao)数(shu)字PCR反(fan)应体系(xi)(xi)当中,每个反(fan)应体系(xi)(xi)包含11 μL 2x Supermix、2.2 μL 10x引物和探针(zhen)、8.8 μL的(de)(de)(de)(de)水(shui)做阴性(xing)对照或3.3 μL毕赤(chi)酵(jiao)(jiao)母(mu)DNA和5.5 μL的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白质药(yao)物(或者水(shui))。随后将(jiang)体系(xi)(xi)分(fen)割(ge)成纳米级(ji)的(de)(de)(de)(de)微滴,进行PCR扩增,然后检测荧光信号(hao)并对药(yao)物中酵(jiao)(jiao)母(mu)细胞残留DNA进行定量分(fen)析。


DNA Std (fg):

酵母细胞(bao)DNA量,6000、600、60、6、0 fg

DNA Std+RP-1:

酵母细胞(bao)DNA加25 μg RP-1

DNA Std+Insulin:

酵母细胞DNA加50 μg 胰(yi)岛素

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图1

数字(zi)PCR检测RP-1和胰岛素中毕赤酵母细胞残留DNA线性范(fan)围

总结

1. 数字PCR对(dui)细(xi)胞残(can)留(liu)DNA的检(jian)测灵(ling)敏(min)度可以(yi)达到qPCR的5倍(bei)或以(yi)上,可以(yi)满(man)足每(mei)1 mg蛋白质药物中(zhong)≤1 pg宿主细(xi)胞DNA残(can)留(liu)检(jian)测的要求。

2. 数(shu)字PCR作为(wei)一种精确、灵敏(min)的检测方法,无需DNA标准曲线,可以直接定量(liang)检测RP-1和胰(yi)岛素生物药中酵母(mu)细(xi)胞残留DNA。

3. 该方法同(tong)样适(shi)用(yong)于其他生(sheng)物药中(zhong)宿主细胞DNA残留(liu)检测(ce)。


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