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综述|数字PCR在新冠肺炎检测中的应用

发布日期:2021-01-14

摘要

2021新(xin)年伊(yi)始,光明日(ri)报报道,国(guo)际计量(liang)局近日(ri)在其网站上公布了新(xin)冠病毒(du)核(he)(he)酸测(ce)(ce)量(liang)国(guo)际比对(dui)结果。比对(dui)结果表明,数字(zi)(zi)PCR法可在全世(shi)界(jie)范围内实(shi)现对(dui)新(xin)冠病毒(du)核(he)(he)酸含量(liang)的高(gao)精确(que)(que)测(ce)(ce)量(liang)。该比对(dui)由中国(guo)计量(liang)院提出和联合(he)主(zhu)导(dao),世(shi)界(jie)多个国(guo)家(jia)计量(liang)机构参与,有利于提高(gao)世(shi)界(jie)各国(guo)新(xin)冠病毒(du)核(he)(he)酸测(ce)(ce)量(liang)结果的一(yi)致性和准确(que)(que)性。数字(zi)(zi)PCR,因为新(xin)冠病毒(du)检测(ce)(ce),走进了公众视野(ye)。


研究内容

近期,清华大学医学院(yuan)生物医学工程(cheng)系郭永团队在《VIEW》期刊发(fa)表了题为 “Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic” 的综述文章。

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在这篇文章中(zhong),作者介绍了数字(zi)PCR的(de)原理和优点,综述(shu)了数字(zi)PCR在COVID-19大流(liu)行(xing)中(zhong)的(de)应用,并讨(tao)论了数字(zi)PCR在COVID-19及相关临床应用中(zhong)的(de)挑战。


基于液滴数字PCR的SARS-CoV-2检测工作流程:

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A:配制(zhi)含(han)有靶(ba)标(biao)(biao)(biao)检(jian)测(ce)(ce)引物和(he)探针的(de)(de)(de)(de)(de)混合液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye),SARS-CoV-2检(jian)测(ce)(ce)中多使(shi)用(yong)Taqman探针法,以N基(ji)因和(he)ORF1ab基(ji)因作(zuo)为靶(ba)点;B:采用(yong)微流控(kong)芯片生成油包(bao)水液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di);C:收(shou)集液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)至PCR管中;D:使(shi)用(yong)热循(xun)环仪进行(xing)液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)PCR扩增,扩增后,原(yuan)包(bao)含(han)有靶(ba)标(biao)(biao)(biao)核酸分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)内(nei)部的(de)(de)(de)(de)(de)核酸量将达到百亿量级(ji),靶(ba)标(biao)(biao)(biao)分(fen)(fen)子(zi)在扩增的(de)(de)(de)(de)(de)过程中和(he)荧光(guang)(guang)基(ji)团结合,使(shi)其能(neng)接受光(guang)(guang)信号的(de)(de)(de)(de)(de)激(ji)(ji)发并释放荧光(guang)(guang)信号;E:液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)逐个(ge)通过由激(ji)(ji)光(guang)(guang)光(guang)(guang)源和(he)光(guang)(guang)电(dian)检(jian)测(ce)(ce)的(de)(de)(de)(de)(de)检(jian)测(ce)(ce)位,不包(bao)含(han)靶(ba)标(biao)(biao)(biao)分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)的(de)(de)(de)(de)(de)被激(ji)(ji)发光(guang)(guang)信号较(jiao)弱(阴性液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)),包(bao)含(han)有荧光(guang)(guang)靶(ba)标(biao)(biao)(biao)分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)被激(ji)(ji)发光(guang)(guang)信号较(jiao)强(阳性液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)),同(tong)时(shi)对阴阳性液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)进行(xing)计数;F:基(ji)于(yu)泊松分(fen)(fen)布,计算(suan)原(yuan)始靶(ba)标(biao)(biao)(biao)分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)浓度(du),图(tu)中散点的(de)(de)(de)(de)(de)位置代表了携带不同(tong)靶(ba)标(biao)(biao)(biao)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)(ye)滴(di)(di)。


数字PCR优势:

1)绝(jue)对(dui)(dui)(dui)定量:通(tong)过(guo)对(dui)(dui)(dui)反(fan)应单元的(de)微分(fen)、终(zhong)点检测(ce)和泊松分(fen)布数学模型,在不依赖标(biao)准品的(de)前提下,可(ke)实现对(dui)(dui)(dui)靶标(biao)分(fen)子的(de)绝(jue)对(dui)(dui)(dui)定量;

2)更(geng)高(gao)的(de)(de)(de)灵敏度(du):对反应单元进行微分(fen)的(de)(de)(de)同时(shi),降低(di)了(le)每个(ge)反应单元中非靶标(biao)分(fen)子的(de)(de)(de)占比,从(cong)而提(ti)高(gao)了(le)靶标(biao)分(fen)子的(de)(de)(de)扩(kuo)增效率和检测(ce)灵敏度(du),对一些稀有突变的(de)(de)(de)检出(chu)率可以提(ti)高(gao)到0.001%;

3)更(geng)好的稳定(ding)性:微分反应单元(yuan)的同时也对(dui)PCR反应抑(yi)制(zhi)剂进行了稀(xi)释,因此(ci)数字PCR显示出比荧光定(ding)量(liang)PCR(qPCR)更(geng)好的抑(yi)制(zhi)剂耐受(shou)性,可以在复(fu)杂样(yang)品(pin)的检(jian)测(ce)中实(shi)现更(geng)好的检(jian)出;

4)更(geng)高的精度:在区分(fen)更(geng)细(xi)微的拷(kao)贝数(shu)(shu)差异(yi)时,与qPCR相比(bi),数(shu)(shu)字PCR表(biao)现(xian)出更(geng)好(hao)的区分(fen)能力,结果具有更(geng)小的变异(yi)系(xi)数(shu)(shu)(CV值)。


数字PCR,在COVID-19诊断和治疗中发挥重要的作用:

1)对SARS-CoV-2的高敏检测:尽管逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)方法是目前COVID-19诊断的金标准,但其被报道存在假阴性率高的问题,而数字PCR的检测限(LoD)比RT-qPCR更低,在一些临床样本的检出中,数字PCR检测结果跟临床诊断的结果一致性比RT-qPCR更好,因此对于低病毒载量样品的检测,数字PCR可作为RT-qPCR的重要补充。

2)评估不同类型的临床样本的病毒载量:COVID-19测试可使用多种类型的临床样品,包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液等,选择合适的样本类型对于准确的临床诊断至关重要。数字PCR可对上述样本中的病毒载量进行定量,Yu等人的研究发现,痰液中病毒载量最高,其次是鼻拭子和咽拭子,提示了使用痰液和鼻咽拭子作为测试样本能够增加阳性检出率。

3)样本制备方法评估:安全处理疑似COVID-19病例的样本对于保护医学实验室人员免受感染伤害至关重要。Chen等人使用数字PCR定量三种灭活方法处理前后样本中的病毒量,结果表明灭活处理会降低可检测的病毒RNA的数量,可能导致假阴性结果;而且相比热灭活,使用TRIzol试剂灭活对病毒RNA的影响最小。这项研究表明,数字PCR可作为评估核酸样本预处理效果的有效方法。

4)动态监测疾病进展:在临床管理和治疗中,密切监视病人的病情进展非常重要。对于大多数病毒感染引起的疾病,病毒载量越高,疾病病情越重。因此,研究病毒载量与COVID-19严重程度之间的关系非常重要,数字PCR的高灵敏和高精度使其能够监测患者病毒载量的变化。Yu等使用了数字PCR来定量检测样本中的病毒载量,结果显示患者在整个疾病过程中的不同时间点病毒载量有差异,疾病早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期,说明动态监测病毒载量变化有助于评估疾病的进展。

5)核酸参考品的制备:数字PCR可以对核酸进行绝对定量,因此,它已被用于标定核酸参考物质。例如,van Kasteren等用数字PCR定量SARS-CoV-2的拷贝数,用于制备标准物质,并将RNA进行梯度稀释以评估不同RT-qPCR试剂盒的分析性能。Fung等用数字PCR检测阳性患者样本中的病毒载量并准备了系列梯度稀释液,以确定7种SARS-CoV-2检测方法的LoD。因此,数字PCR可为国家机构,例如国家食品药品监督管理局、中国计量科学研究院或者企业单位制备SARS-CoV-2核酸标准品提供可靠方法。

6)监测环境中病毒浓度:对公共环境中存在的病毒进行监测是新冠预防和控制的重要环节,Liu等使用数字PCR检测新冠爆发期间武汉两家医院不同区域气溶胶中的病毒RNA,发现在大多数情况下无法在公共区域检测到SARS-CoV-2 RNA;气溶胶中病毒RNA的浓度在隔离病房和通风病房较低,但是在病人及医疗工作人员使用的厕所区域较高,根据这些结果,他们认为SARS-CoV-2可能通过气溶胶传播。Lv等使用RT-qPCR和数字PCR检测残留在实验室相关物体表面的病毒,例如样品运输和接待相关设施、测试仪器和个人防护设备等。RT-qPCR检测结果显示所有样本均为阴性,而61个样本中 数字PCR检测出13份样本为阳性;SARS-CoV-2 RNA密度最高的是处理病毒样本的实验室人员的手套外侧。这些研究表明,数字PCR可以监测在不同的环境中病毒RNA,为疾病预防和消毒策略提供依据。

7)SARS-CoV-2突变的检测:RNA病毒具有很高的突变率,这与毒力和进化能力相关。病毒突变研究对于评估病毒耐药性、了解与免疫有关的逃逸机制和发病机理至关重要。Wong等开发了基于数字PCR的检测方法来检测Vero-E6传播的分离株、人类类器官、实验感染的仓鼠和COVID-19患者样本中的PRRA位点或位点上游缺失变异;PRRA缺失的蝙蝠状冠状病毒变异体可以在COVID-19患者中自然存在,而且仍然可以传播,但这些变异在自然感染中的频率较低,表明它们的竞争性不如插入PRRA的野生型。这项研究表明数字PCR适用于检测已知的SARS-CoV-2突变,尤其是针对一些低频突变的检测。

8)抗SARS-CoV-2病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)药(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)评(ping)估:病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)减少(shao)是抗病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)药(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)(you)效(xiao)(xiao)性的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)要指标,例如,在(zai)瑞(rui)德西韦针对成人重(zhong)(zhong)症COVID-19患者的(de)(de)(de)(de)(de)一项(xiang)研究中(zhong), Wang等(deng)监测了(le)受(shou)试(shi)者呼吸道标本(ben)的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang),以确定药(yao)(yao)物(wu)是否(fou)可(ke)以加速(su)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)下降或降低(di)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)检出率;此外,Zhu等(deng)人监测了(le)患者的(de)(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang)变化来(lai)评(ping)估阿比多尔(er)和(he)洛(luo)匹那韦/利托那韦治疗(liao)COVID-19的(de)(de)(de)(de)(de)治疗(liao)效(xiao)(xiao)果。其中(zhong)Wang等(deng)人通过(guo)标准曲线确定病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang),Zhu等(deng)人仅使用(yong)Ct值来(lai)表现病(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)载(zai)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)变化。由于数字(zi)PCR能够实现不依(yi)赖标准曲线的(de)(de)(de)(de)(de)绝对定量(liang),而且能够检测到拷(kao)贝数的(de)(de)(de)(de)(de)微小(xiao)差异(yi),作者认为数字(zi)PCR比RT-qPCR更适合用(yong)于评(ping)价抗SARS-CoV-2药(yao)(yao)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)(you)效(xiao)(xiao)性,能够给出更具说服(fu)力和(he)准确的(de)(de)(de)(de)(de)评(ping)价结果。


总结:

作为一种新(xin)兴的绝对(dui)(dui)定量技术,数(shu)字(zi)PCR对(dui)(dui)低丰(feng)度DNA更加(jia)灵(ling)敏和(he)特异,能够(gou)绝对(dui)(dui)定量,对(dui)(dui)扩增抑(yi)制剂的抗性更强(qiang)。数(shu)字(zi)PCR的技术优势(shi)在(zai)SARS-CoV-2的核酸检(jian)(jian)(jian)测(ce)中得到了完整的体现,在(zai)低拷贝病(bing)毒(du)(du)样(yang)本检(jian)(jian)(jian)测(ce)、临(lin)床(chuang)样(yang)本病(bing)毒(du)(du)载(zai)量定量、参考品制备(bei)、环境中病(bing)毒(du)(du)浓度定量、病(bing)毒(du)(du)突变(bian)检(jian)(jian)(jian)测(ce)和(he)药(yao)物评价等多方面扮演了重要的角色(se)。


在临床检测中,数字PCR仍有进步空间:

1)通(tong)量:数(shu)字PCR系统的样(yang)品检测通(tong)量需要进一步提高,以满足COVID-19大规模筛查的需求(qiu);

2)自动(dong)化:需要操(cao)作流程更简(jian)单、自动(dong)化程度更高(gao)的数字PCR系统来简(jian)化复杂的操(cao)作过程,减少手动(dong)操(cao)作时间;

3)成本(ben):需(xu)要进(jin)一步降(jiang)低仪器及(ji)试剂耗材(cai)的成本(ben),提高市(shi)场竞争力;

4)标(biao)准(zhun)及批文:需要制定国家或行业统(tong)一标(biao)准(zhun),推出商品化的室内质控品;多(duo)中(zhong)心(xin)评估(gu):基于数字PCR的SARS-CoV-2核酸检测(ce)试剂盒需要经过多(duo)中(zhong)心(xin)性(xing)能评估(gu)测(ce)试、获(huo)得相关监(jian)管部门批准(zhun)(FDA/NMPA等),才能为临床诊断提(ti)供合(he)规依据(ju)。

新羿生物新型冠状病(bing)毒 2019-nCoV 核酸定量(liang)检(jian)测解决方案

面(mian)对新(xin)冠(guan)疫情,新(xin)羿(yi)生(sheng)物充(chong)分发挥科技优势,其(qi)团队凭借丰富的重大疾病诊(zhen)断技术(shu)研(yan)究经验(yan),春节无休开发出高灵敏度的新(xin)冠(guan)核酸检(jian)测(ce)试剂盒,提供了新(xin)冠(guan)病毒精准诊(zhen)断的利器。

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新羿TD-1数(shu)字PCR平台

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新冠病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒


新羿(yi)生物新冠(guan)解决方案特点(dian)

1. 灵(ling)敏度高:最低(di)检测下限(xian)100 copies/mL;

2. 定量准(zhun)(zhun)确:无需标(biao)准(zhun)(zhun)品和(he)标(biao)准(zhun)(zhun)曲线;

3. 通量较高:一次PCR可以完(wan)成96样本;

4. 操(cao)作简便:一步上样,操(cao)作简单;

5. 封(feng)闭检(jian)测(ce):全封(feng)闭体(ti)系检(jian)测(ce),可防止(zhi)气溶胶污染(ran),预防假阳性;

6. 特异性好:与其他(ta)常见(jian)呼吸(xi)道病原体(病毒、细菌、真(zhen)菌)无交叉(cha)反应。

论文链接:DOI: 10.1002/VIW.20200082

光明(ming)日报(bao)文章链接:

参考(kao)文献:(略)