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新羿数字PCR:非小细胞肺癌原发EGFR T790M突变检测研究

发布(bu)日(ri)期:2020-12-22

摘要

北京大(da)学人民医(yi)院(yuan)胸外(wai)科杨帆团(tuan)队和清华大(da)学医(yi)学院(yuan)生物医(yi)学工程系郭永团(tuan)队合作,在《OncoTargets and Therapy》发表(biao)题(ti)为(wei)"Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of de novo EGFR T790M Mutation in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer"的研究(jiu)论文,该研究(jiu)使用新羿TD-1数字PCR平台,验证了非(fei)小(xiao)细胞肺癌病人中原发EGFR T790M突变(bian)与共(gong)存的致敏EGFR突变(bian)在等位基因上(shang)的顺反(fan)式(shi)关系(顺式(shi)排(pai)列(lie)指(zhi)(zhi)两个(ge)位点在同(tong)一条(tiao)DNA分(fen)(fen)子(zi)上(shang),反(fan)式(shi)排(pai)列(lie)则是指(zhi)(zhi)两个(ge)位点不在同(tong)一条(tiao)DNA分(fen)(fen)子(zi)上(shang),这两种不同(tong)排(pai)列(lie)方式(shi)导致患(huan)者对药(yao)物的敏感性不一样(yang)),并探索(suo)了福尔马林固定(ding)石(shi)蜡包(bao)埋(mai)(FFPE)组(zu)织(zhi)样(yang)本对检测原发EGFR T790M突变(bian)的影响。

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方法与结果

该研究(jiu)入组(zu)(zu)了300例中(zhong)国非小细(xi)胞肺癌患(huan)者(zhe),所有(you)病(bing)人(ren)都未使用过EGFR-TKIs。对(dui)(dui)于(yu)前250例患(huan)者(zhe)(A组(zu)(zu)),通(tong)过外(wai)科(ke)手术获取肿(zhong)瘤组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)后快(kuai)速冷冻(dong)后保存于(yu)-80℃;对(dui)(dui)于(yu)后50例患(huan)者(zhe)(B组(zu)(zu)),获取病(bing)人(ren)的(de)肿(zhong)瘤组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)和(he)癌旁正(zheng)常(chang)组(zu)(zu)织(zhi)(zhi),并(bing)分(fen)别制(zhi)作(zuo)成冰(bing)冻(dong)肿(zhong)瘤组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)、FFPE肿(zhong)瘤组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)、冰(bing)冻(dong)正(zheng)常(chang)组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)和(he)FFPE正(zheng)常(chang)组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)。对(dui)(dui)A组(zu)(zu)的(de)250例冰(bing)冻(dong)肿(zhong)瘤组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)进(jin)行EGFR基(ji)因(yin)突变(bian)(bian)检测(ce)(ce)(ce),并(bing)对(dui)(dui)同时检出(chu)T790M突变(bian)(bian)和(he)致敏EGFR突变(bian)(bian)的(de)样(yang)本进(jin)行等位基(ji)因(yin)顺反式(shi)检测(ce)(ce)(ce)。对(dui)(dui)B组(zu)(zu)的(de)4种(zhong)类型样(yang)本进(jin)行EGFR基(ji)因(yin)突变(bian)(bian)检测(ce)(ce)(ce),分(fen)析4种(zhong)类型样(yang)本中(zhong)T790M突变(bian)(bian)比例。(详细(xi)流(liu)程见图(tu)1)

300例冰冻组织EGFR检测结果如下表:

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对3例(li)为(wei)L858R+T790M双阳性样本(ben)(ben)。进一(yi)步构建了L858R+T790M双重检测体(ti)系(xi),用总RNA分析(xi)L858R和(he)T790M的(de)顺(shun)反式关系(xi),结果表明,这3例(li)样本(ben)(ben)均为(wei)顺(shun)式关系(xi),即L858R和(he)T790M突变存在于同(tong)一(yi)条DNA分子上(图2)。

图2(A)显示了野生(sheng)型(xing)EGFR的(de)NSCLC细胞系(xi)的(de)FAM非(fei)特异性信号(hao)。(B、C、D)3例NSCLC患者(zhe),同时伴有原(yuan)(yuan)发(fa)T790M和(he)(he)L858R突变,用ddPCR方法检(jian)测两(liang)种突变的(de)等位基因(yin)关系(xi),B、C、D所示为EGFR的(de)原(yuan)(yuan)发(fa)T790M(FAM标(biao)(biao)记)和(he)(he)L858R(VIC标(biao)(biao)记)的(de)双(shuang)阳性信号(hao), FAM和(he)(he)VIC阴性信号(hao)以(yi)黑色表(biao)(biao)示。野生(sheng)型(xing)EGFR L858R和(he)(he)野生(sheng)型(xing)T790M突变的(de)信号(hao)以(yi)蓝色表(biao)(biao)示。EGFR L858R突变阳性的(de)信号(hao)以(yi)绿色表(biao)(biao)示。原(yuan)(yuan)发(fa)T790M伴随顺式L858R突变的(de)双(shuang)阳性信号(hao)以(yi)橙(cheng)表(biao)(biao)示。

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对B组的50例病人的4种类型样本进行19Del、L858R和T790M检测,发现T790M在癌旁正常组织FFPE样本的丰度为0.1%-0.5%,而同样的冰冻组织的突变丰度均低于0.1%。这提示在用FFPE样本检测T790M突变时,需仔细确认判读的cut off。

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研究结论

1.中国NSCLC原发T790M突变发生率很低,在本研究中只有1.3%。

2.本(ben)研究(jiu)发现(xian)的3例L858R+T790M双(shuang)阳(yang)性样本(ben)为(wei)顺式(shi)突变(bian),数字PCR可(ke)以有(you)效检出。

3.福尔马林固(gu)定(ding)造(zao)成的(de)人工突(tu)变会影(ying)响(xiang)FFPE样本(ben)的(de)T790M突(tu)变检测(ce)(ce)。所以使用ddPCR检测(ce)(ce)FFPE样本(ben)前(qian),应(ying)仔细验证ddPCR检测(ce)(ce)体系(xi)的(de)分(fen)析cut off值。

作者介绍

北京大学人民医院胸外科王迅主治医生为该论文的第一作者,北京大学人民医院胸外科杨帆教授与清华大学医学院郭永教授为论文的合作通讯作者。原文链接: